BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri termofilik merupakan suatu kelompok bakteri yang akan tumbuh optimum pada suhu tinggi (Nam et.al. 2004). Struktur bakteri termofilik berbeda dengan sel-sel eukariotik karena kemampuannya untuk beradaptasi dan tumbuh pada suhu tinggi serta kondisi ekstrim. Kondisi ekstrim seperti salinitas tinggi (konsentrasi NaCl pekat), pH ekstrim (kurang dari 2 dan lebih dari 10), dan tekanan substrat yang sangat tinggi atau sangat rendah. Menurut (Andrade et.al. 1999), Bakteri termofilik dapat di kelompokan berdasarkan suhu pertumbuhannya, yaitu termofilik (45-65°C), ekstrim termofilik (65-85°C), dan hipertermofilik (85-110°C).

Kandungan enzim dan protein pada bakteri termofilik lebih stabil dan tahan panas dibandingkan dengan bakteri mesofil, molekul yang mensintesis protein (seperti ribosom dan komponen lainnya) juga stabil terhadap panas, serta membran lipid sel termofilik mengandung banyak asam lemak jenuh yang membentuk ikatan hidrofobik yang sangat kuat merupakan faktor faktor utama yang membuat bakteri termofilik dapat hidup lebih lama di kondisi yang ekstrim (Brock, 1986). Bakteri termofilik dapat mensintesis enzim yang mampu mengkatalis reaksi-reaksi biokimia pada suhu tinggi dan hasilnya lebih stabil dibandingkan dengan enzim dari mesofil. Enzim ini tidak hanya stabil terhadap suhu tinggi tetapi juga terhadap protein-protein denaturan, seperti detergen, pelarut organik, serta enzim protease (Andrade et. al. 1999).

Jumlah dan jenis bakteri yang berada dalam habitat alaminya berada dalam populasi campuran. Teknik isolasi digunakan untuk memperoleh biakan murni yang terdiri atas satu jenis bakteri yang diinginkan. Tahap pertama dalam proses isolasi adalah pengambilan mikroba dari habitat aslinya. Teknik pengambilan mikroba harus sesuai dengan ekologi organisme tersebut dalam lingkungan alaminya. Faktor penting yang harus diperhatikan dalam mengisolasi bakteri adalah komponen media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri tersebut.

Media harus berisi nutrisi yang sesuai untuk pertumbuhan bakteri. Selain nutrisi, hal lain yang perlu diperhatikan adalah faktor lingkungan yang sesuai, seperti keasaman dan suhu media. Kondisi pH yang tidak sesuai dapat merusak struktur dinding sel bakteri sehingga merusak sistem metabolismenya (Pelczar & Chan 2008). Medium darland diketahui dapat mempercepat bakteri termofilik tumbuh (Huber dkk, 1991). Huber mengatakan, archaea termoasidofilik berbentuk kokus yang tidak beraturan dapat diperkaya dalam medium darland. Medium allend digunakan oleh Handayani dkk, (2012) untuk mendapatkan bakteri termofilik dari Kawah Domas Gunung Tangkuban Perahu. Medium NA juga diketahui dapat menumbuhkan bakteri termofilik genus Bacillus yaitu pada suhu 45oC diinkubasi selama 48 jam (Irena, 2010).

Sifat keunggulan bakteri termofilik sangat diperlukan oleh industri-industri berbasis enzim. Bakteri termofilik menawarkan keuntungan dalam bidang industri dan bioteknologi modern (Mayende, 2006) oleh karen itu, penting untuk dilakukan isolasi dan aklimatisasi.

1.2 Identifikasi Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas maka identifikasi masalah yang dapat

dikemukakan adalah:

Berapa isolat yang didapatkan dari Kawah Domas Gunung Tangkuban Perahu
Medium apa yang dapat menumbuhkan isolat bakteri termofilik asal Kawah Domas Gunung Tangkuban Perahu paling optimum

1.3 Maksud dan Tujuan Penelitian

Maksud dari penelitian ini adalah mendapatkan isolat bakteri termofilik dari Kawah Domas Gunung Tangkuban Perahu dengan tujuan mendapatkan medium yang paling optimum untuk pertumbuhan bakteri termofilik yang berasal dari air kawah Gunung Tangkuban Perahu.

1.4 Kegunaan Penelitian

Kegunaan hasil penelitian ini adalah menjadi studi dasar untuk penelitian mengenai manfaat bakteri termofilik yang berada di Kawah Domas Gunung Tangkuban Perahu sehingga selanjutnya dapat dikembangkan dan diaplikasikan untuk peningkatan skala produksi bioteknologi yang lebih murah dan efisien.

1.5 Metodologi Penelitian

Penelitian ini dianalisis menggunakan metode deskriptif. Air sampel yang berasal dari Kawah Domas Gunung Tangkuban Perahu dimasukkan kedalam medium cair (Darland, Thermus dan TSA) yang memiliki pH berbeda (2, 4, dan 6) diinkubasi pada suhu 60oC selama 1 minggu. Bakteri yang tumbuh dipindahkan ke medium padat yang memiliki pH 6. Koloni yang tumbuh diidentifikasi menggunakan identifikasi fenotipik.

1.6 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan Laboratorium Mikrobiologi Eijkman Unit Laboratorium Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat (LPPM) FK Unpad dari bulan Oktober sampai November 2018.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Bakteri Termofilik

Bakteri termofilik merupakan mikroorganisme yang memiliki suhu pertumbuhan optimal diantara 60-108oC (Beal, 2018).

2.1.1 Faktor Lingkungan Pertumbuhan Bakteri Termofilik

Sumber air panas termasuk kedalam media pertumbuhan yang cocok bagi bakteri termofilik. Suhu yang dapat ditoleransi oleh bakteri termofilik mencapai 90°C. Habitat alami bakteri termofilik tersebar di seluruh permukaan bumi, salah satunya pada sumber-sumber air panas, kawah gunung berapi atau daerah vulkanik (Martharina, 2010 dalam Tuntun dan Misbahul., 2014).

Bakteri termofilik selain ditemukan pada sumber air panas, ditemukan juga dari sumur minyak bumi. Isolat-isolat tersebut hidup dalam kondisi oksigen yang relatif sedikit dengan suhu 40-90 °C (Endah Pratita and Putra, 2012).

2.1.2 Jenis-Jenis Bakteri Termofilik

Secara umum mikroorganisme terbagi dalam empat kelompok berdasarkan suhu lingkungan tempatnya hidup, yaitu psikrofil, mesofil, termofilik, dan hipertermofilik. Bakteri psikrofil merupakan bakteri yang tumbuh pada kisaran suhu 0-20oC. Bakteri mesofil tumbuh pada suhu 45-65oC. Bakteri hipertermofilik hidup pada suhu 90-100oC namun beberapa bakteri hidup hingga 113oC (Prescott, 2005).

Gambar 2.1 Korelasi Suhu dan Pertumbuhan pada Kelompok Mikroorganisme

dengan Temperatur yang Berbeda (Madigan et. al., 2009).

2.1.3 Pertumbuhan Bakteri

Bakteri termofilik pertama kali diisolasi pada suhu 72oC oleh Miquel. Species termofilik umumnya banyak ditemukan pada lingkungan yang ekstrim seperti daerah vulkanik, lumpur panas, sedimen hutan geothermal, dan sumber air panas. Bakteri termofilik dapat tumbuh di suhu yang ekstrim dikarenakan bakteri ini menghasilkan enzim termostabil. Pada lingkungan yang kurang cocok, bakteri ini menghasilkan enzim termostabil. Pada lingkungan yang kurang cocok, bakteri termofilik membentuk endospor sehingga lebih tahan hidup dari bakteri psikrofil (Sutiamihirja, 2008).

Terdapat tiga faktor yang membuat bakteri termofilik mampu bertahan hidup dan berkembang biak pada suhu tinggi :

Kandungan enzim dan protein yang lebih stabil
Molekul yang mensistesis protein lebih stabil terhadap panas,
Membran lipid sel termofilik mengandung banyak asam lemak jenuh membentuk ikatan hidrofobik yang sangat kuat.

2.1.4 Morfologi Makroskopis Bakteri

Bakteri yang tumbuh dapat dilihat karateristiknya melalui bentuk, warna, tepiam dan elevasi koloni (Ginting, 2009 dalam Simandjuntak and Samuel, 2018). Berikut morfologi makroskopis koloni bakteri termofilik yang ditemukan di Danau Linow menurut (Simandjuntak and Samuel, 2018).

Gambar 2.2 Karakteristik Morfologi dari bakteri termofilik yang diisolasi dari Danau Linow.

2.2 Medium Pertumbuhan

Peremajaan dilakukan dalam media Thermus cair. Media Thermus merupakan media spesifik yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri termofilik. Media ini mengandung ekstrak khamir, pepton, dan garam-garam mineral berupa amonium sulfat, magnesium sulfat, kalsium klorida, kalium fosfat, dan natrium klorida. Ekstrak khamir merupakan sumber nitrogen, gula, nutrisi organik maupun anorganik sedangkan pepton berfungsi sebagai sumber nitrogen yang menyediakan asam amino dan peptida pendek. Garam-garam mineral berfungsi menyediakan nutrisi anorganik untuk menopang pertumbuhan bakteri (Hartanti, 2010).

2.2.1 Tryptone

Tryptone merupakan macam macam peptide yang dibentuk dari hasil pengolahan kasein oleh tripsin protease. Tryptone secara umum digunakan dalam mikrobiologi untuk membuat medium pertumbuhan bakteri karena mengandung asam amino yang baik untuk pertumbuhan bakteri (Fraser, 2014).

2.2.2 Yeast Extract

Yeast extract mengandung beberapa komponen yang diperlukan oleh pertumbuhan bakteri seperti asam amino, protein, karbohidrat dan vitamin. Enzim memecah protein yang ada dalam sel ragi menjadi komponen yang lebih kecil dan menghancurkan dinding sel sehingga isinya larut keluar dari sel. Dinding sel yang tersisa dihilangkan dengan sentrifugasi (EURASYP, 2016).

2.3 Gunung Tangkuban Perahu

Gunung Tangkuban Perahu merupakan salah satu gunung yang berada di Provinsi Jawa Barat Indonesia. Gunung Tangkuban Perahu mempunyai ketinggian setinggi 2.084 meter. Bentuk gunung ini adalah Stratovulcano dengan pusat erupsi yang dapat berpindah dari timur ke barat. Jenis batuan yang dikeluarkan melalui letusan kebanyakan adalah lava dan sulfur. Mineral yang dikeluarkan adalah sulfur belerang, mineral yang dikeluarkan saat gunung tidak aktif adalah uap belerang. Daerah Gunung Tangkuban Perahu dikelola oleh Perum Perhutanan.

Berdasarkan klasifikasi dari Schmidt dan Ferguson, iklim pada kawasan ini termasuk tipe iklim B dengan curah hujan rata-rata 2.000 – 3.000 mm/tahun. Temperatur berkisar antara 15°C - 29°C dan kelembaban udara rata-rata 45% - 97% (BKSDA, 2016).

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya yaitu autoklaf, batang L, botol steril, bunsen, cawan petri, erlenmeyer, gelas beaker, heater, inkubator, laminar air flow, mikropipet, ose, oven, kertas filter ukuran 0.45 µm, kertas pH, sentrifugasi, stirrer, tabung reaksi, tabung sentrifugasi, termos, thermometer, dan timbangan analitis.

3.1.2 Bahan

Air dari kawah, alkohol, aquades steril, gliserol 50%, gelulite, dan LB (1% tryptone dan 1% yeast).

3.2 Metode Penelitian

3.2.1 Pembuatan Medium

Pembuatan medium bakteri dilakukan sebelum pengambilan sampel. Terdapat 3 jenis medium bakteri yang dipersiapkan dalam bentuk cair dan padat. Medium cair digunakan saat aklimatisasi sedangkan medium padat digunakan untuk melihat morfologi koloni bakteri. Semua jenis medium cair pH diatur menjadi 2, 4, dan 6 menggunakan HCL dan KOH sedangkan medium padat diatur menjadi pH 6 untuk kemudian ditambahkan 1.5% bakto agar.

Medium Darland

Medium darland cair dan padat disiapkan sesuai dengan Handayani et.al., (2012). Komposisi medium darland adalah 3 g KH2PO4, 1,02 g MgSO4, 0,25 g CaCl2, 0.2 g (NH4)SO4, 1g Ekstrak Khamir, dan 5g Glukosa. Semua bahan dimasukkan ke dalam aquades 1 L kemudian disterilisasi

Medium Thermus

Medium thermus cair dan padat disiapkan sesuai dengan Hartanti, (2010). Komposisi medium thermus adalah 0,3 KH2PO4, 0,25 g MgSO4, 0,125 g CaCl2, 0,1 g (NH4)SO4, 2 g Ekstrak Khamir, 4 g Pepton, dan 1 g NaCl. Semua bahan dimasukkan ke dalam aquades 1 L kemudian disterilisasi.

Medium TSA

Medium Tryptic Soy Agar Oxoid ditimbang sebanyak 40 g, dilarutkan ke dalam 1 L aquades kemudian disterilisasi.

Medium TSB

Medium Tryptic Soy Broth ditimbang sebanyak 30 g, dilarutkan ke dalam 1 L aquades kemudian disterilisasi

Luria Bertani

Medium Luria Bertani ditimbang sebanyak 25 g, dilarutkan ke dalam 1 L aquades kemudian disterilisasi.

3.2.2 Tahap Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan di kawasan Taman Wisata Alam Kawah Gunung Tangkuban Perahu pada minggu ketiga Oktober. Pengambilan sampel digunakan metode sampling purposif yaitu berdasarkan adanya pertimbangan (Yudo dan Nusa, 2018). Pertimbangan ini berhubungan dengan lokasi sumber kegiatan yang diduga terdapat melimpahnya bakteri termofilik. Pengambilan sampel terdiri dari :

Pengambilan data Fisika dan Kimia

Data fisika dan kimia diperlukan untuk mengetahui kondisi alam setiap titik sehingga dapat dikaitkan dengan perbedaan kelimpahan bakteri termofilik disetiap stasiun. Data fisika yang diambil adalah suhu sedangkan data kimia yang diperlukan adalah pH.

Pengambilan Sampel Air Kawah

Sampel air kawah di setiap stasiun diambil menggunakan termos sebanyak 100 mL.

3.2.3 Tahap Pelaksanaan

Tahap pelaksanaan terdiri dari isolasi bakteri termofilik yang diawali dengan aklimatisasi bakteri pada tiga jenis medium berbeda yang memiliki pH (2, 4, dan 6) selama seminggu di suhu 60oC. Endapan bakteri yang muncul pada medium cair ditanam kembali di medium padat di suhu 60oC. Koloni yang muncul diamati morfologi makroskopisnya kemudian diidentifikasi fenotipiknya. Identifikasi fenotipik terdiri dari pewarnaan gram, spora, uji katalase, dan uji oksidase selanjutnya diidentifikasi secara genotipik menggunakan 16s rRNA yang dilakukan di BPPT.

Aklimatisasi

Disiapkan 9 mL medium darland cair, thermus cair, TSB yang memiliki pH berbeda (2, 4, dan 6) dan Luria Bertani (LB) pada tabung reaksi. 1 mL sampel air dari Kawah Domas dimasukkan kedalam tabung yang sudah berisi medium. Diinkubasi selama 1 minggu pada suhu 60oC.

Isolasi Bakteri Termofilik

Endapan bakteri yang terdapat pada masing-masing medium cair diambil sebanyak 200 µL ditanam pada medium padat dengan cara metode cawan sebar (spread plate). Diinkubasi selama 1 minggu pada suhu 60oC, diamati setiap hari. Morfologi makroskopis koloni bakteri yang diamati meliputi ukuran (diameternya), ada atau tidaknya pigmen, menonjol atau rata, keruh atau bening, suram atau mengkilat, permukaan rata (Smooth) atau tidak rata (Rough) tepi pinggiran koloni, dan konsistensi (berlendir atau tidak). Koloni yang tumbuh berbeda bentuk dan warna dipisahkan ke medium baru untuk tahap pemurnian.

Pewarnaan Gram

Biakan bakteri yang masih fresh diambil menggunakan ose lalu digoreskan pada kaca preparat yang sudah di sterilisasi terlebih dahulu. Preparat kering ditetesi kristal violet selama 1 menit, dibilas menggunakan akuades, ditetesi kembali lugol selama 1 menit, dibilas menggunakan akuades, ditetesi alkohol 96% selama 10 detik, dibilas dengan akuades, ditetesi dengan zat warna pembanding yaitu safranin selama 1 menit dan dibilas dengan akuades. Kaca preparat dikeringkan secara perlahan lalu diamati dibawah mikroskop. Bakteri gram positif akan berwarna ungu dan bakteri negatif akan berwarna merah (Mahmudah dkk, 2016).

Pewarnaan Spora

Pewarnaan spora dilakukan dengan cara membuat suspensi bakteri dengan cara penambahan NaCl fisiologis dengan perbandingan 1:1 yang sesuai dengan (Pratita dan Putra, 2012). Campuran tersebut dipanaskan pada penangas air dengan suhu 80oC selama 5-10 menit. Preparat dibuat dengan dari campuran tersebut dikeringkan dan difiksasi sebanyak tiga kali yang selanjutnya ditetesi H2SO4 selama 2 detik, kemudian dicuci dengan akuades. Ditetesi zat warna kedua yaitu methylene blue selama 5 menit kemudian dicuci dengan akuades dan dikeringkan. Preparat diamati dibawah mikroskop. Spora berwarna merah sedangkan badan vegetatif berwarna biru

Uji Oksidase

Pengujian oksidase dilakukan sesuai dengan (Norman dkk, 2017) menggunakan kertas oksidase (OxiStrips) Medix Item Code: BOS-0093. Koloni 24 jam diambil menggunakan batang ose disposable plastik lalu digores-goreskan ke kertas oksidase. Hasil uji positif ditandai dengan perubahan warna menjadi ungu. Bakteri oksidase-positif memungkinkan bakteri tersebut untuk mengoksidase reagen yang mengandung amina tertentu.

Uji Katalase

Pengujian katalase dilakukan sesuai (Setiawan, 2016), yaitu diambil sedikit biakan bakteri dengan menggunakan jarum ose. Disuspensikan biakan tersebut pada setetes larutan H2O2 3% pada gelas objek. Diamati segera apakah timbul gelembung-gelembung gas sampai jangka waktu 5 menit setelah pencampuran dengan H2O2 3%. Hasil positif ditandai dengan adanya gas (gelembung) dan hasil negatif tidak menunjukan hasil tersebut.

Optimasi Medium

Bakteri termofilik yang tumbuh paling mendominasi diuji ke beberapa medium untuk diketahui medium yang paling optimum untuk menumbuhkan bakteri termofilik. Koloni bakteri disuspensikan ke dalam NaCl fisiologis dan disetarakan dengan 1 McFarland. Setiap 1 mL suspensi bakteri dimasukkan ke dalam 9 mL medium cair TSB, thermus, dan darland diinkubasi pada suhu 60oC diamati setiap 24 jam sekali selama 120 jam. Setiap 24 jam medium cair yang berisi bakteri diambil 200 µL untuk ditanam di medium padat sehingga dapat diamati pertumbuhan koloninya.

Identifikasi genotipik

Identifikasi genotipik merupakan tahapan identifikasi lanjutan secara molekuler. Tahapan kerja identifikasi mikroba berdasarkan daerah gen 16s rRNA dengan menggunakan PCR dan analisis sekuens DNA terdiri dari ekstraksi genome DNA, amplifikasi PCR, elektroforesis produk PCR, purifikasi gel produk PCR, amplifikasi PCR cycle sekuens, purifikasi produk PCR cycle sekuens, sekuensing, dan analisis BLAST.

Ekstraksi Genom DNA (BPPT, 2019)

Ekstraksi genom DNA menggungan FASTDNA kit. kultur cair disentrifuse, hingga didapat pellet 50-100mgr. Lysing matrix disiapkan sesuai sampel yang akan diisolasi. sampel dalam lysing matrix dimasukan dan ditambahkan 1000 μL CLS TC. Sampel dihomogenisasi dengan FastPrep instrument selama 40 detik pada kecepatan 4500 rpm dan diinkubasi dalam wadah es selama 2 menit, disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 14.000 xg.

Supernatan sebanyak 600-700 μL dipindahkan ke dalam tabung 1,5 ml yang baru dan ditambahkan 600 μl Binding matrix dihomogenisasi dengan pipet secara hati-hati dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang dan disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 14.000 xg. Supernatan dibuang, pellet diresuspensi dengan menambahkan 500 μL SEWS-M. Sentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 14.000 xg. Supernatan dibuang, ditambahkan 100 μl DES untuk mengelusi DNA, inkubasi selama 5 menit pada suhu 55oC. Sentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 14.000 xg. Supernatan dipindahkan sebanyak 50µL yang mengandung DNA ke tabung 1,5 ml yang baru, DNA disimpan pada suhu 4oC.

Amplifikasi PCR (BPPT, 2019)

Dalam tabung 0,2 mL dibuat campuran dengan kandungan seperti pada tabel 3.2 dengan tapping secara pelan pelan, larutan di spindow dengan sentrifugasi. Mesin thermal cycle diatur sesuai dengan program PCR yaitu 3 menit pada suhu 94oC, 30 siklus (1 menit pada suhu 94oC, 1 menit pada suhu 55oC, 2 menit pada suhu 72oC), 10 menit pada suhu 72oC dan 4oC.

Tabel 3.2 Campuran bahan untuk amplifikasi PCR

Bahan	Konsenstrasi Akhir	Volume Sampel
Air		36,75 μL
PCR buffer 10x + 25 mM MgCl2	1x	5 μL
dNTPs mix	0.2 mM	4 μL
Forward primer (8F) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG	10 mM	1 μL
Reverse primer (1492 R)	10 mM	1 μL
Taq DNA Polymerase	1.5 U	0.25 μL
Template DNA	100-200 ng	2 μL
Total volume		50 μL

(Sumber : BPPT 2019)

Elektroforesis produk PCR (BPPT, 2019)

Agarose di timbang 1% (w/v), dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi buffer TAE 1x, dipanaskan dalam microwave sampai benar-benar larut, didinginkan sampai suhu 40-50oC. SYBR SAFE 10.000x ditambahkan dan dituang dalam cetakan gel (pastikan tidak ada gelembung udara) dibiarkan sampai beku. Sisir dilepaskan dari cetakan gel. Cetakan dimasukkan dalam tangki elektroforesis (pastikan seluruh bagian gel terendam dalam buffer TAE 1x). Marker DNA yang mengandung loading dye 6x dimasukkan ke dalam sumur pada gel. Elektroforesis dijalankan pada 100 V selama 30 menit pita DNA divisualisasi di atas UV illuminator dan didokumentasikan dengan gel documentation system.

Purifikasi gel produk PCR (BPPT, 2019)

Tabung 1,5 mL kosong ditimbang. Agarosa yang mengandung fragmen DNA dipotong dengan scalpel, dimasukkan ke tabung yang sudah ditimbang. Tabung yang sudah berisi gel di timbang. Selisih berat dihitung (tabung berisi gel dengan berat kosong (berat gel ± 300mg)). Buffer DF ditambahkan sebanyak 500 µL pada sampel dan dihomogenkan dengan cara divorteks selanjutnya diinkubasi pada 55-60oC selama 10-15 menit sampai semua agarosa larut (tabung dibolak-balik setiap 2-3 menit).

Gel yang sudah larut, sampel didinginkan hingga suhu ruang. DF kolom ditempatkan pada tabung 2 mL. Sampel dipindahkan ke DF kolom (lebih dari 700µL) dan di sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit. Larutan dari tabung dibuang 2 mL kemudian DF kolom ditempatkan kembali pada tabung 2 mL. Wash buffer ditambahkan sebanyak 600 µL dan disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit. Larutan dari tabung 2 mL dibuang kemudian DF ditempatkan kembali pada tabung 2 mL, sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit.

Amplifikasi PCR cycle sekuens (BPPT, 2019)

Dalam tabung PCR 0.2 mL dibuat campuran dengan kandungan yang sesuai pada Tabel 3.3. tapping secara pelan-pelan. Larutan di spindown dengan sentrifugasi. Mesin thermal cycle diatur sesuai program PCR yaitu 2 menit pada suhu 96oC, 25 siklus (10 detik pada suhu 96oC, 5 detik pada suhu 55oC, 4 menit pada suhu 60oC) dan 4oC

Purifikasi produk PCR cycle sekuens (BPPT, 2019)

Sampel hasil PCR Cycle sekuensing ditambah 10 µL air bebas DNA dan RNA (sampai 20 µL). larutan EDTA 125 mM ditambahkan 5 µL, larutan natrium asetat 3 M sebanyak 5 µL dan 60 µL etanol absolute. Sampel diinversi sebanyak 4 kali, dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 g selama 30 menit. Supernatan dibuang, pelet ditambah 70 µL etanol 70%. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 1.650 g selama 15 menit. Supernatan dibuang. Sisa etanol 70% dihilangkan dengan cara spindown, dikeringkan menggunakan vacum desikator selama 10 menit, dielusi dengan 10 µL air bebas DNA dan RNA dan dipanaskan dengan heat block digital pada suhu 42°C selama 5 menit, tapping perlahan setiap 2 menit. Larutan dispindown dengan sentrifugasi.

Sekuensing dan Analisis BLAST

Produk PCR cycle sekuensing yang sudah di purifikasi di sekuensing menggunakan AB 3130 Genetic Analyzer sehingga didapatkan basa nucleotide. Urutan DNA hasil sekuensing diedit dengan menterjemahkan N menjadi basa sesuai elektroferogram. Urutan DNA dicopy ke program NotePad. BLAST menggunakan website http://www.ncbi.nih.nlm.gov. Identifikasi contoh sesuai dengan TOP similarity.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Hasil terdiri dari data pengambilan sampel air kawah Domas Gunung Tangkuban Perahu meliputi data fisika dan kimia, karakteristik koloni isolat bakteri termofilik, isolat bakteri termofilik yang tumbuh, optimasi medium dan data identifikasi genotipik.

4.1.1 Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel air Kawah Domas Gunung Tangkuban Perahu dilakukan pada hari Jumat 14 Desember 2018 pada jam 8.30 WIB. Data fisika dan kimia disajikan dalam Tabel 4.1. Karakteristik lingkungan diambil untuk diketahui kondisi awal lingkungan bakteri termofilik yang akan diisolasi.

Tabel 4.1 Hasil Data Fisika dan Kimia Pengambilan Sampel Air Kawah Domas Gunung Tangkuban Perahu

Kode Lokasi	Titik Kordinat	Suhu	pH
K1	S06o45.693’E107o37.551’	45	1-2
K2	S06o45.694’E107o37.537’	86	1-2

4.1.2 Isolasi Bakteri Termofilik Kawah Domas Gunung Tangkuban Perahu

Kultur cair bakeri termofilik yang sudah diaklimatisasi ditanam pada medium padat dengan metode cawan sebar (spread plate) diinkubasi pada suhu 60oC selama 7-14 hari dan diamati karakteristik koloni isolat bakteri termofilik setiap hari. Pada hari ke 9 koloni bakteri tumbuh pada medium, diamati bentuk bakteri dan pewarnaan gram untuk kemudian dimurnikan. Koloni bakteri yang tumbuh pada medium agar padat memiliki karakteristik seperti yang disajikan pada tabel 4.2 berikut.

Tabel 4.2 Karakteristik Isolat Bakteri Termofilik Kawah Domas Gunung Tangkuban Perahu

Kode Isolat	Karakteristik	Gram	Spora	Oksidase	Katalase
TS61A Asal Lokasi K2	Koloni berbentuk titik, warna kuning, bentuk sirkular, margin undulate, elevasi flat Bakteri berbentuk basil pendek Tumbuh pada pH 6	-	+	+	+
D61A Asal Lokasi K2	Koloni berbentuk kecil, warna putih, bentuk sirkular, margin serrate elevasi flat Bakteri berbentuk basil pendek Tumbuh pada pH 6	+	+	+	+
L61A (Geobacillus uzenensis) Asal lokasi K1	Koloni berbentuk kecil, warna kuning, bentuk sirkular, margin entire, elevasi flat. Bakteri berbentuk basil panjang. Tumbuh pada pH 6 Tumbuh paling mendominasi diantara bakteri yang lain	+	+	+	+

Dari berbagai jenis koloni tersebut, dipilih satu koloni bakteri yang paling dominan yaitu L61A untuk selanjutnya dilihat medium yang paling optimum menumbuhkan bakteri termofilik dan diidentifikasi genotipik

4.1.3 Pengamatan Optimasi Medium

Optimasi medium dilakukan untuk mengetahui medium yang paling baik untuk pertumbuhan bakteri termofilik asal Kawah Domas Gunung Tangkuban Perahu. Bakteri L61A disuspensikan ke dalam NaCl fisiologis sehingga setara dengan 1 Mc Farland kemudian dimasukkan kedalam medium cair untuk selanjutnya diinkubasi pada suhu 60oC selama 24 jam, 48 jam, 72 jam, 96 jam, dan 120 jam. Kultur bakteri yang sudah diinkubasi masing-masing diambil sebanyak 200 µL untuk selanjutnya ditanam ke media padat dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 60oC. Pertumbuhan bakteri diamati setiap hari. Data optimasi medium disajikan pada tabel 4.3, dari data tersebut dapat disimpulkan bahwa medium termus lebih optimum untuk menumbuhkan bakteri termofilik L61A.

Tabel 4.3 Hasil Data Pertumbuhan L61A pada Berbagai Macam Medium

Medium	24 jam	48 jam	72 jam	96 jam	120 jam
Thermus	+	+++	+++	++	+
Darland	++	+
TSA	+	++	++	+

Keterangan :

+ : terdapat 1-15 koloni bakteri

++ : terdapat 16-30 koloni bakteri

+++ : terdapat lebih dari 31 koloni bakteri

4.1.4 Data Identifikasi Genotipik

Identifikasi bakteri dilakukan melalui analisis sekuens 16S rRNA. Pada isolat bakteri L61A yang diidentifikasi menggunakan analisis sekuens gen 16S rRNA didapatkan hasil Geobacillus uzenensis strain LMG 24725 dengan similarity 100%.

BAB V

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian, didapatkan simpulan sebagai berikut

Isolat bakteri yang didapatkan dari air Kawah Domas Gunung Tangkuban sejumlah 3 isolat yaitu TS61A, D61A, dan Geobacillus uzenensis
Medium termus dapat menumbuhkan bakteri Geobacillus uzenensis asal Kawah Domas Gunung Tangkuban Perahu paling optimum.

DAFTAR PUSTAKA

Andrade, C.M.M.C, Nei Pereira Jr., and G. Antranikian. 1999. Extremely Thermophilic Microorganisms and Their Polymerhidrolytic Enzyme. A reviews, departmen of Technology Microbiology, Technical University Hamburg Germany. Revista de Microbiologia No. 30:287-298

Beal, Heater. 2018. Microbial Life in Extremely Hot Environments. https://serc.carleton.edu/microbelife/extreme/extremeheat/index.html. (Diakses pada 2 November 2018 pukul 12.31 WIB).

BBKSDA. 2016. Cagar Alam Gunung Tangkuban Perahu. http://bbksdajabar.ksdae.menlhk.go.id/wp-content/uploads/2017/08/Profil-Bidwil-2-Fix_skw_4_tangkuban-perahu.pdf. (Diakses pada tanggal 6 Oktober 2018 pukul 14.52 WIB)

Brock, T.D. 1986) Thermophiles: General, Molecular, and Applied Microbiology. New York: John Wiley & Son.

Endah Pratita, M. Y. and Putra, S. R. (2012) ‘Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Termofilik Dari Sumber Mata Air Panas Di Songgoriti Setelah Dua Hari Inkubasi’, Teknik Pomits, Vol. 1(1), pp. 1–5.

EURASYP. 2014. Frequently Asked Question of Yeast Extract. European Association for Specialty Yeast Products. http://www.yeastextract.info/faq (Diakses pada 4 November 2018 pukul 3.05 WIB)

Fikrinda, Iswandi A., Tresnawati P., D. Andreas S., 2000, Isolasi dan Seleksi Bakteri Penghasil Selulase Ekstremofil dari Ekosistem Air Hitam, Jurnal Mikrobiologi Indonesia, Vol 5, 48-53

Fraser, Dean and Richard Powell,. 2014. The Kinetics of Trypsin Digestion. The Journal of Biological Chemistry.

Habibie, Fadeli Muhammad., Agustin Krisna Wardani., dan Mochamad Nurcholis. 2014. Isolasi Dan Identifikasi Molekuler Mikroorganisme Termofilik Penghasil Xilanase Dari Lumpur Panas Lapindo. Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 2 No 4 p.231-238

Hartanti. 2010. ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI SELULOLITIK TERMOFILIK DARI KAWAH AIR PANAS GUNUNG PANCAR, BOGOR 1 HARTANTI Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia DEPARTEMEN’, skripsi.

Ibrahim ASS, El-diwany AI. 2007. Isolation and identification of new cellulases producing thermophilic bacteria from an Egyptian hot spring and some properties of the crude enzyme. J Appl Sci 1:473-478.

Madigan, M.T., J.M. Martinko, and J. Parker. 2009. Biology of Microorganisms. (edisi kedua belas). New York: Prentice Hall International.

Mahmudah, R., B, M. and Sappewali 2016. Identifikasi Isolat Bakteri Termofilik Dari Sumber Air Panas Lejja, Kabupaten Soppeng’, Al-Kimia, 4((1)), pp. 31–42.

Mayende L, Wilhelmi BS, Pletschke BI. 2006. Cellulase (CMCase) and polyphenol oxidase from thermophilic Bacillus spp. isolated from compost. Soil Biol Biochem 38:2963-2966.Nam etal 2014

Nurhatika, Sri. 2010. Rancangan Acak Kelompok. http://share.its.ac.id/pluginfile.php /1340/mod_resource/content/1/METPEN-BAB8.pdf (Diakses pada Senin, 15 Oktober 2018 pukul 23.00 WIB)

Patel, KS., Jinal HN., Sejal C., and Natarajan A. 2017. Characterization of culturable bacteria isolated from hot springs for plant growth promoting traits and effect on tomato (Lycopersicon esculentum) seedling. C. R. Biologies http:// dx.doi.org/10.1016/j.crvi.2017.02.005

Pelczar MJ, Chan ECS. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jilid 1. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, Penerjemah; Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari: Elements Of Microbiology.Prescot 2005

Simandjuntak, S. and Samuel, M. Y. 2018. Isolation and Identification of Thermophilic Bacteria , Producer of Amylase Enzyme , from Lake Linow , North Sulawesi’, 12(June), pp. 543–554.

Sunaryanto, R. 2011 ‘Isolasi, purifikasi, identifikasi, dan optimasi medium fermentasi antibiotik yang dihasilkan oleh aktinomisetes laut’.

Sutiamiharja, N. 2008. Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Amilase Kasar Termofilik dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatra Utara. (Tesis). Universitas Sumatra Utara.

Tuntun, M. et al. (2014) ‘Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Termofilik Dari Sumber Air Panas Way Panas Bumi Natar Lampung Selatan Isolation and identification of thermophilic bacteria from Hot Springs’, 3(1), pp. 297–304.

LAMPIRAN

Lampiran 1. Lokasi Pengambilan Sampel Air Kawah Domas Gunung Tangkuban Perahu